Les enzymes en biologie moléculaire:

Les enzymes vont permettre de travailler sur les acides nucléiques.
Leur première fonction va être de les couper en petites molécules facilement analysable.
Les enzymes de restrictions permettent disposent d'outil permettant d'avoir toujours le même petite molécule à partir d'une grande molécule d'ADN.
La coupure est très précise.
Avec les techniques d'électrophorèse, on pourra séparer chacune des petites molécules et travailler dessus.

Le terme :

    *Il provient de la bactériologie :

    *Les virus bactériophage sont capables d'infecter des bactéries et de s'y multiplier à des milliers d'exemplaires. Ils finissent par lyser les bactéries.

    *Dans certains cas, ce mécanisme ne se produit pas : on a appelé restrictions ce phénomène car le virus infectant a été coupé par des enzymes présentent dans la bactérie d'où le terme d'enzymes de restrictions.

Nomenclature :

                    -une lettre majuscule : initiale de l'espèce bactérienne.
                    -deux lettres minuscules : genre de la bactérie.                                                                                            ex: Escherichia coli RY 13
                    -une lettre majuscule : la souche de la bactérie.                                                                                                 EcoR I
                    -un chiffre Romain : le numéro d'ordre de découverte de l'enzyme de cette espèce.

Mécanisme d'action :

3 possibilités :

                                        * Enzymes de type I :

Elles reconnaissent le site sur l'ADN et coupent la molécule très loin au-delà de ce site. 1000 à 5000 nucléotides au-delà.
La coupure est assez aléatoire : enzyme inutile en biologie moléculaire.

                                        * Enzyme de type II : endonucléases.

Elles reconnaissent le site et coupe à cet endroit. Utilisés en biologie moléculaire.

                                        * Enzyme de type trois:

Elles reconnaissent le site et coupe une vingtaine de nucléotides plus loin.

Mode d'action des enzymes de type II :

                                        * Reconnaissance :

Elle reconnaissent la séquence de nucléotides comportant 4 à 8 nucléotides.
Se sont la plupart du temps des séquences palindromiques.
Pour certaines les nucléotides doivent être exactement ceux désignés par l'enzyme.
Parfois un des nucléotides est aléatoire.

Par exemple EcoR I a une reconnaissance absolue

GAATTC peut-elle se retrouver une fois ou plusieurs fois au sein d'une molécule d'ADN.
Statistiquement on admet que pour qu'une séquence ne soit reconnue qu'une seule fois, dans une molécule d'ADN, il faut qu'elle possède au moins 20 nucléotides.
Ici, avec 6 nucléotides, on va avoir plusieurs fois cette séquence donc on obtiendra plusieurs brins.

                                        * Coupure :

Deux types de coupures :

        *coupure à bouts cohésifs.
        *coupure à bouts francs.

*Coupure à bouts cohésifs:

Coupure intéressante car elle permet de fabriquer des hybrides.
deux molécules d'ADN différent : possédant la même séquence reconnue par EcoR I

On peut mettre ensemble, ces quatre molécules et obtenir de molécules. Il y a autant de chances pour que l'une d'entre elles se recombinent avec une autre.
C'est une technique très utilisée dans les différentes manipulations.
On est capable de jouer avec les molécules.
Systématiquement on utilise les propriétés initiales de complémentarité des bases.

*Coupure à bouts francs:

La transcriptase reverse :

Elle transcrit l'ARN en ADN complémentaire ou ADNc.
Elle a été découverte sur les rétrovirus. (Un rétrovirus est constitué uniquement d'un ARN).
Elle possède une activité RNAse H c'est-à-dire qu'elle détruit le brins d'ARN dans les hybrides ADN-ARN.
Elle est utilisée pour fabriquer des banques d'ADN, l'ARN étant instable.

L'ADN polymérase I :

C'est la première enzyme découverte.
Elle possède trois activités :
                    * Une polymérasique faible : répare l'ADN dans les cellules.
                    * Deux activités de destruction de l'ADN : l'une exonucléasique 3'
                                                                                    l'autre exonucléasique 5'

Il faut uniquement la molécule d'ADN simple brin plus une amorce : il y a fabrication dans le sens 5' 3' du brin complémentaire.
On appelle cette enzyme le fragment de KLENOW.
Elle correspond à une partie de l'enzyme qui conserve son activité polymérasique mais qui a perdu son activité exonucléasique 5' 3'.

La terminal transfèrase:

Elle catalyse l'addition de désoxynucléotide sans matrice du côté OH 3' de l'ADN.
L'élongation se fait au hasard des deux côtés dans le sens 5' 3'
Elle permet de créer une queue poly A ou poly U pour isoler ensuite la molécule d'ADN.

ARN polymérase:

Elle transcrit L'ADN monobrin en un ARN.
Elle fonctionne toujours dans le sens 5' 3'.
Elle permet de fabriquer des sondes, c'est à dire des fragments d'ARN complémentaires de l'ADN.
Au lieu de mettre des nucléotides classiques, on met des nucléotides marqués, on obtient donc une sonde marquée.
On place la sonde dans un milieu contenant de l'ADN dont on ne connaît pas la nature et il y a hybridation de la sonde avec l'ADN complémentaire et on peut donc visualiser la sonde radioactive.

Les ligases:

Elles assurent la liaison entre OH 3' d'un ADN et 5' phosphate d'une autre molécule.
Utile quand on a utilisé une enzyme de restriction.
Pour réaliser une liaison entre deux molécules hybrides, reliées par un liaison H, on a besoin d'une ligase plus de l'ATP.

Nucléases:

* soit DNAse
* soit RNAse
Selon le site d'action, le substrat sur lequel elles vont agir.

Leur mode d'action est variable selon l'origine.

                * Endonucléase: attaque les molécules à l'intérieur.
                * Exonucléase: 3' ou 5' elles détruisent les extrémités.
                * Nucléase S1: détruit tous ce qui est simple brin.
                * RNAse H: Détruit tous les hybrides ADN AR N en éliminant toutes les fractions d'ARN

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